血清總補(bǔ)體溶血活性（CH50）測(cè)定操作說(shuō)明書(shū)

點(diǎn)擊次數(shù)：8556 日期：2018/7/6 12:37:36

血清總補(bǔ)體溶血活性（CH50）實(shí)驗(yàn)原理

利用綿羊細(xì)胞與相應(yīng)抗體（溶血素）結(jié)合成的復(fù)合物，可激活血清中的補(bǔ)體，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，當(dāng)紅細(xì)胞和溶血素量一定時(shí)，在規(guī)定反應(yīng)的時(shí)間內(nèi)，溶血程度與補(bǔ)體量及活性呈正相關(guān)。在接近50%溶血（CH50）時(shí)，二者之間近似直線關(guān)系，故以50%溶血作為最敏感的判斷終點(diǎn)。以引起50%溶血所需的最小補(bǔ)體量為一個(gè)CH50U，可計(jì)算出待測(cè)血清中總的補(bǔ)體溶血活性，以CH50U/ml表示。

本試驗(yàn)主要反映補(bǔ)體經(jīng)典活化途徑的溶血功能，其結(jié)果與補(bǔ)體C1～C9各組成分的量及活性均有關(guān)。

1．試劑及配制

(1)緩沖生理鹽水：

①貯存液：

lNa2HPO4•12H2O 2.85g

lKH2PO4 0.27g（加蒸餾水至100毫升，4℃保存）

lNaCl 17.00g

②應(yīng)用液（緩沖液）：5毫升貯存液加95毫升蒸餾水，再加10%硫酸鎂0.1毫升。當(dāng)日配制。12小時(shí)內(nèi)使用。

（2）2%綿羊紅細(xì)胞（From：南京森貝伽生物公司）：無(wú)菌采取綿羊血液，于等量Alsever液中可保存3周。用前以緩沖液洗3次，并配成2%細(xì)胞懸液。必要時(shí)可用吸光光度法或細(xì)胞計(jì)數(shù)法使懸液細(xì)胞濃度標(biāo)準(zhǔn)化。

(3)凍干綿羊紅細(xì)胞溶血素（From：南京森貝伽生物公司）（規(guī)格：0.5ml/瓶，0.5ml蒸餾水復(fù)溶）：將本品（效價(jià)1：4000），用緩沖液作1：2000倍稀釋?zhuān)ḿ?.5ml溶血素加999.5毫升緩沖液）。

(4)待測(cè)血清：新鮮血液室溫放置30分鐘，再4℃放置60分鐘，使血塊收縮。4℃離心（3000r/min）10分鐘，取上清，-20℃保存。

2.試管法操作步驟（改良Mayer法）

（1）致敏羊紅細(xì)胞：2%綿羊紅細(xì)胞加等量稀釋后的溶血素（1：2000），混勻，置37℃水浴30分鐘。

（2）稀釋血清：待測(cè)血清0.2ml，加緩沖液3.8ml，稀釋度為1：20。

（3）配制溶血標(biāo)準(zhǔn)管：2%綿羊紅細(xì)胞2ml加8ml蒸餾水，混勻，即為全溶血管。取全溶血管液2ml加緩沖液2ml，即為50%溶血管。

（4）按表所示，依次加各成分于試管中，混勻，置37℃水浴30分鐘。第10管為非溶血對(duì)照。

補(bǔ)體CH50測(cè)定試管法

成分	試管號(hào)
成分	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1：20待測(cè)血清	0.10	0.15	0.20	0.25	0.30	0.35	0.40	0.45	0.50	-
緩沖液(ml)	1.40	1.35	1.30	1.25	1.20	1.15	1.10	1.05	1.00	1.50
致敏紅細(xì)胞（ml）	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1

（5）結(jié)果測(cè)定：取出試管，2000r/min離心10分鐘，對(duì)照管應(yīng)不溶血。肉眼比色，選與50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管相近二管，再用分光光度計(jì)測(cè)（波長(zhǎng)542nm、0.5cm比色杯）OD值，確定與標(biāo)準(zhǔn)管最接近者為終點(diǎn)管，然后按下公式計(jì)算CH50值：血清補(bǔ)體CH50（U/ml）=（1/血清用量）×稀釋度。

如第5管為終點(diǎn)管，測(cè)待測(cè)血清中CH50為66.7U/ml。血清補(bǔ)體CH50正常值為50-100U/ml。

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